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植物組織培養(yǎng)
煙草的再生
前言 植物的組織培養(yǎng)廣義又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞，原生質體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產具有經濟價值的其他產品的技術。狹義是指組培指用植物各部分組織，如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經過再分化形成再生植物。
在實踐中，根據所培養(yǎng)的植物材料的不同，可以把組織材料分為5種類型，即愈傷組織、懸浮細胞培養(yǎng)、器官培養(yǎng)（胚、花藥、子房、根和莖的培養(yǎng)等）、莖尖分生組織和原生質體培養(yǎng)。這5種培養(yǎng)類型雖然各有特點，但又相互有聯系。例如，愈傷組織常常是懸浮細胞和原生質體的來源，但是很多情況下，懸浮細胞和原生質體最終又要通過形成愈傷組織才能產生再生植株。
19世紀30年代，德國植物學家施萊登和德國動物學家施旺創(chuàng)立了細胞學說，根據這一學說，如果給細胞提供和生物體內一樣的條件，每個細胞都應該能夠獨立生活。1902年，德國植物學家哈伯蘭特在細胞全能性的理論是植物組培的理論基礎。1958年，一個振奮人心的消息從美國傳向世界各地，美國植物學家斯蒂瓦特等人，用胡蘿www.stanzs.com卜韌皮部的細胞進行培養(yǎng)，終于得到了完整植株，并且這一植株能夠開花結果，證實了哈伯蘭特在五十多年前關于細胞全能的預言。植物組培的簡單過程如下：剪接植物器官或組織——經過脫分化形成愈傷組織——再經過再分化形成組織或器官——經過培養(yǎng)發(fā)育成一顆完整的植株。植物組培的大致過程是：在無菌條件下，將植物器官或組織（如芽、莖尖、根尖或花藥）的一部分切下來，用纖維素酶與果膠酶處理用以去掉細胞壁，使之露出原生質體，然后放在適當的人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，這些器官或組織就會進行細胞分裂，形成新的組織。不過這種組織沒有發(fā)生分化，只是一團薄壁細胞，叫做愈傷組織。在適合的光照、溫度和一定的營養(yǎng)物質與激素等條件下，愈傷組織便開始分化，產生出植物的各種器官和組織，進而發(fā)育成一棵完整的植株。 植物組織培養(yǎng)具有很多優(yōu)點。第一，其培養(yǎng)條件可以人為控制，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，
便于穩(wěn)定地進行周年生培養(yǎng)。第二，其生長周期短，繁殖率高。第三，管理方便，利于工廠化生產和自動化控制，與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲等一系列繁雜勞動，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。
組織培養(yǎng)一方面可為轉基因育種提供理想的受體材料，另一方面又可為常規(guī)的植物改良程序提供一種新的手段，從而使很多用傳統(tǒng)方法難以解決的問題迎刃而解，更多更快地創(chuàng)造出各種農作物和園藝植物的新品種、新類型和新種質�？偟膩砜矗M織培養(yǎng)在植物改良中發(fā)揮了主要的作用，相信隨著培養(yǎng)的技術不斷的進步，其將會發(fā)揮更大的作用。
一、 實驗目的
1. 了解與掌握植物組織培養(yǎng)的原理和過程。
2. 了解與學習植物組織培養(yǎng)的相關操作技術。
3. 通過學習植物組織培養(yǎng)技術學習自我總結、自我反思，讓自己在今后的學習與生活中也能像做組織培養(yǎng)那樣細心、有條理。
二、 實驗原理
動物細胞的分化一般是不可逆的，植物則不同。只要具有一個完整的膜系統(tǒng)和一個有生命力的核，即使是已經高度成熟和分化的細胞，也還保持著回復到分生狀態(tài)的能力。
把已分化組織中不分裂的靜止細胞從母體植株上分離下來置于一種能促進細胞增殖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，細胞內就會發(fā)生某些變化，例如在休止期間由于溶酶體的破壞活動而喪失了功能的細胞組分又恢復了功能等，從而使細胞進入分生狀態(tài)。一個成熟轉變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)并形成未分化的愈傷組織的現象稱作“脫分化”。在組織培養(yǎng)中，把如上述由活植物體上切取下來以進行培養(yǎng)的那部分組織或器官叫做外植體。外植體通常都是多細胞的，并且組成它們的細胞常常包括各種不同的類型，因此由一個外植體所形成的愈傷組織也是異質性的，其中不同的組分細胞具有不同的形成完整植株的能力，即不同的“再分化”能力。
一個植物細胞能產生一個完整植株的固有能力稱這為細胞的全能性（Cell
totipotency）。換句話說，細胞全能性是指植物細胞具有全套遺傳信息，不管是性細胞還是體細胞，在特定環(huán)境下仍能進行表達，而產生一個獨立完整的個體。
細胞一旦脫離了母體植株，擺脫了原來所受到的遺傳上的控制和生理上的制約，在一定的培養(yǎng)條件下，就會發(fā)生一種回復變化，從而失去分化狀態(tài)，變?yōu)榉稚毎�，實現脫分化過程。然后，這些脫分化細胞經過連續(xù)的有絲分裂，形成愈傷組織，即指在人工培養(yǎng)基上外植體長出來的一團無序生長的薄璧細胞。
脫分化細胞不斷進行分裂，從而形成了愈傷組織，愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間以后，由于營養(yǎng)物質枯竭，水分散失，以及代謝產物的積累，必須轉移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這個過程叫做繼代。
當試管苗在瓶內長滿并長到瓶塞，或培養(yǎng)基利用完時就要轉接，進行繼代，可迅速得到大量試管苗，以便到一定數量時進行移栽。能否保持試管苗的繼代培養(yǎng)，是能否得到大量試管苗和能否用于生產的重要問題。
因此，按培養(yǎng)過程可分為初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)兩種類型：
（1）初代培養(yǎng)（Primary culture）：指外植體的最初培養(yǎng)。
（2）繼代培養(yǎng)（Subculture）：將初代培養(yǎng)得到的培養(yǎng)體移植于新鮮培養(yǎng)基中這種反復多次移植的培養(yǎng)，稱為繼代培養(yǎng)。
若按照組織培養(yǎng)的材料可分為：（1）組織、器官或細胞培養(yǎng)：指利用生物體各部分組織、器官或細胞進行離體培養(yǎng)，使之形成愈傷組織或完整有機體的技術。
（2）原生質體培養(yǎng)：指將微生物或植物細胞游離成原生質體，在適宜培養(yǎng)條件下，依據細胞全能性使其再生細胞壁，并進行細胞分裂分化，形成完整個體的技術。
植物組織培養(yǎng)過程為：
脫分化
再分化
三、 實驗材料和儀器
材料：煙草的葉片， MS培養(yǎng)基所需的各類藥品，蔗糖，瓊脂，1mol/L的NaOH，
1mg/ml的6—ＢＡ，70%酒精，升汞溶液，無菌水
儀器：電子天平，玻璃棒，大燒杯，移液管，洗耳球，量筒，搪瓷杯，電爐，
ｐＨ計，漏斗，牛皮紙，培養(yǎng)皿，組培瓶，錐形瓶，濾紙，高壓蒸汽滅
菌鍋，無菌操作臺，鑷子，解剖刀，酒精燈
四、 實驗步驟
（一）配制母液
１.根據書上的相關數據計算配制母液所需藥品的用量，和小組其他成員檢查核對數據，確定用量。（具體用量見表１）
２.將所需的藥品準備好，按照表１的數據進行母液的配制，配制好后寫好標簽，按順序擺放好母液。
注意事項：
1.計算配制母液藥品用量時要小心仔細，不要出現計算錯誤。計算完畢后應和小組成員仔細核對，以確保計算無誤。
2.在稱取藥品時一定要看清藥品的名稱和用量，例如不要將K2HPO4 看成是KH2PO4。
3.配制完母液后要寫清標簽，切勿弄混。
（二）MS培養(yǎng)基制備
1..在搪瓷杯里加入適量的水，按照表２，依次將溶液加入搪瓷杯中，攪拌。
2..將所得溶液定容到１Ｌ，調ｐＨ值，使ｐＨ＝６.０。
3.稱取瓊脂條10g，放入搪瓷杯中，放于電爐上加熱，待瓊脂條完全融化后將其
移開，置于室溫下冷卻。
4.待其冷卻一會兒（不燙手時）后將其分裝，總共分裝18瓶。用牛皮紙包好瓶
口，扎上棉線。
5.將其和組培瓶、剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿、濾紙、裝有適量水的錐形瓶放入高溫滅
菌鍋中滅菌。表1
表2
注意事項：
1. 調試pH值要在加熱之前，因為溫度會影響溶液的pH。
2. 在加熱過程中要有人照看，以免溶液因為沸騰而噴灑出來。
3. 在分裝時一定要小心，勿將液體培養(yǎng)基倒在瓶口上，如不小心沾上，要小心擦拭干凈。
（三）初代培養(yǎng)的接種
1. 將所需用具組培瓶、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、解剖刀、無菌水從滅菌鍋取出，準備好75%的酒精，升汞，酒精棉，酒精燈，將它們按一定順序排好待用。
2..接種前用酒精棉擦手，然后換一塊酒精棉擦拭工作臺面，再換一塊酒精棉擦拭鑷子和解剖刀，在等待酒精揮發(fā)的同時將錐形瓶的棉線解開，將棉線理好后放在腿上。
3.采集一片長勢完好的煙草葉片，用75%酒精浸泡數秒鐘，然后用升汞溶液浸泡3min到5min，之后取出，用無菌水漂洗3次。
4.將消毒后的葉片置于無菌濾紙上，用解剖刀將葉片邊緣和兩端切去，留下主脈及其附近的葉肉，后將剩下的葉片切成1cm2左右大小的外植體。
5.左手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶底部，右手輕輕取下包頭紙，將錐形瓶的瓶口靠近酒精燈火焰，瓶口傾斜，。然后用灼燒后冷卻的鑷子將外植體移入瓶中，葉片背面與培養(yǎng)基接觸，輕輕按壓使植物能緊貼培養(yǎng)基。鑷子使用后放回消毒酒精中，將瓶口在火焰上旋轉灼燒數秒鐘，后包扎好瓶口，作好標記。
6.定期觀察煙草的葉片的生長狀況，及時記錄并拍照。
注意事項：
1.用酒精棉給手和臺面以及鑷子和解剖刀消毒時要離酒精燈遠一點，待酒精揮發(fā)干后才可以靠近酒精燈，避免發(fā)生危險。
2.用升汞消毒時要避免消毒時間過長，以免破壞其組織。在消毒過程中要適時晃動一下組培瓶，使葉片與升汞充分接觸。
3.切葉片時切忌切的太小。
4.取下的牛皮紙向下擺放，放好葉片再次用牛皮紙包上錐形瓶之前要用火燒一下瓶口，切忌牛皮紙碰到瓶口。
五、 實驗結果
第一次觀察
第二次觀察
六、 實驗分析與討論
通過照片可以看出，此次實驗成功地長出了愈傷組織。愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間以后，由于營養(yǎng)物質枯竭，水分散失，以及代謝產物的積累，必須轉移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。此次實驗由于課時的限制，所以只進行了初代培養(yǎng)。
植物組織培養(yǎng)是看似簡單實則是很不容易的一門技術。它要求我們每次做實驗都必須要認真、仔細、有條理。不管是哪一次實驗，只要其中的一個環(huán)節(jié)出錯，就有可能導致整個實驗的失敗。所以，認真仔細有條理是做組培的基本條件。
在這次實驗中，經過回想與總結，得出了以下的一些經驗：
1.大量元素的配制：
首先是要確定藥品，不要將藥品名稱看錯。例如不要將K2HPO4 看成是KH2PO4。 這兩樣東西看起來雖然差不多，其實會對實驗產生很大的影響。KH2PO4是酸性的，在此
次實驗中和其他藥品不會產生沉淀，而K2HPO4是堿性的，在此次實驗中會和Mg2+形成
沉淀，影響實驗。在配制大量元素無機鹽母液時，還要防止在混合各種鹽類時產生沉淀，各種藥品必須在充分溶解后才能混合，同時在混合時要注意先后次序，把鈣離子(Ca2+)、錳離子(Mn2+)、鋇離子(Ba2+)和硫酸根離子(SO42-)、磷酸根離子(PO43-)錯開，以免KH2PO4和MgSO4與CaCl2等發(fā)生作用，相互結合生成硫酸鈣、硫酸鋇、磷酸鈣或磷酸錳沉淀。在混合各種無機鹽時，其稀釋度要大，慢慢地混合，同時邊混合邊攪拌。
2.微量元素的配制：
在配制微量元素混合母液時也要注意藥品的添加順序，以免產生沉淀。
3.鐵鹽的配制：
鐵鹽必須單獨配制，因為與其他母液混合容易產生沉淀，在培養(yǎng)基中，采用螯合鐵的形式配制，即硫酸亞鐵和Na2-EDTA的混合物，在pH值7.6~8.0時也可保證鐵的供應源。
4.母液的保存：配制好的母液應分別貼上標簽，注明母液號、配制倍數、日期。
5.MS培養(yǎng)基配制過程，要注意調試pH是在加熱之前，不能加熱之后再調pH，因為溫度會對其產生影響，會導致pH偏大。在分裝的過程中要注意不要將培養(yǎng)基倒在瓶口
上，這樣容易受污染。如不小心瓶口沾上，要小心將其擦拭干凈。
6.初代培養(yǎng)接種過程，在開始的時候不要急著做實驗，要將所有的東西準備好，先在大腦里演示一遍整個實驗的過程以及注意事項，確定無誤后再開始做實驗。實驗過程中一定要保持頭腦冷靜，做到有條不紊。
整個組培的學習過程是有趣的，通過這次的學習，知道了自己的一些不足，在以后的學習生活中，我會一點一點的改正。
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