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革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析
研究了菌齡、涂片厚度、媒染時(shí)間、乙醇脫色程度等對(duì)革蘭氏染色結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，大腸桿菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)時(shí)間不宜超過(guò)25小時(shí)，以下是小編為大家整理的革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析，僅供參考，希望能夠幫助大家。
革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析
革蘭氏染色應(yīng)用(原理，方法，步驟，優(yōu)缺點(diǎn))
1. 革蘭氏染色液簡(jiǎn)介：
革蘭氏染色是一種差異染色方法，用于根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁的特性將細(xì)菌分為兩組（革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性）之一。它也被稱(chēng)為革蘭氏染色法或革蘭氏法。該程序是以發(fā)明該技術(shù)的丹麥細(xì)菌學(xué)家漢斯·克里斯蒂安·格拉姆命名的。
2. 革蘭氏染色的工作原理
革蘭氏染色方法基于某些細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖之間的反應(yīng)。革蘭氏染色包括給：細(xì)菌染色，用染劑固定顏色，使細(xì)胞脫色，并進(jìn)行復(fù)染。
a. 結(jié)晶紫與肽聚糖結(jié)合，將細(xì)胞染成紫色。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞和革蘭氏陰性細(xì)胞的細(xì)胞壁中都含有肽聚糖，所以最初，所有細(xì)菌都會(huì)染成紫色。
b. 碘和碘化鉀用作染色劑或固定劑。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞形成結(jié)晶紫碘復(fù)合物。
c. 用酒精或丙酮使細(xì)胞脫色。革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中的肽聚糖要少得多，因此這一步驟基本上使其無(wú)色，而革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞中只有一些顏色被去除，這些細(xì)胞含有更多的肽聚糖（細(xì)胞壁的60-90%）。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞的厚細(xì)胞壁在脫色步驟中脫水，導(dǎo)致細(xì)胞收縮，并將染色碘復(fù)合物滯留在細(xì)胞內(nèi)。
4. 脫色步驟后，應(yīng)用復(fù)染（通常是藏紅，但有時(shí)是紫紅色）將細(xì)菌染成粉紅色。革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都會(huì)染上粉紅色的污漬，但在革蘭氏陽(yáng)菌的深紫色上看不到。如果正確執(zhí)行染色程序，革蘭氏陽(yáng)性菌將為紫色，而革蘭氏陰性菌將為粉紅色。
3. 革蘭氏染色技術(shù)的目的
用光學(xué)顯微鏡觀察革蘭氏染色的結(jié)果。由于細(xì)菌是有色的，因此不僅可以確定它們的革蘭氏染色組，還可以觀察到它們的形狀、大小和聚集模式。這使得革蘭氏染色對(duì)于醫(yī)療診所或?qū)嶒?yàn)室來(lái)說(shuō)是一種有價(jià)值的診斷工具。雖然染色可能無(wú)法明確識(shí)別細(xì)菌，但通常知道它們是革蘭氏陽(yáng)性還是革蘭氏陰性就足以開(kāi)有效抗生素的處方。
4. 革蘭氏染色技術(shù)的缺點(diǎn)
有些細(xì)菌可能是gram-variable or gram-indeterminate。然而，即使這些信息也可能有助于縮小細(xì)菌的范圍。當(dāng)培養(yǎng)物不到24小時(shí)時(shí)，該技術(shù)最可靠。雖然它可以用于肉湯培養(yǎng)（但最好先離心處理）。該技術(shù)的主要局限性是，如果在該技術(shù)中出錯(cuò)，則會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。要產(chǎn)生可靠的結(jié)果，需要實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和技能。此外，傳染源可能不是細(xì)菌。真核病原體染色為革蘭氏陰性。然而，除真菌（包括酵母）外，大多數(shù)真核細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程中都無(wú)法粘附在載玻片上。
5. 革蘭氏染色所需材料
※ 結(jié)晶紫（主色）
※ 革蘭氏碘液（媒介染劑，用于將結(jié)晶紫固定在細(xì)胞壁中）
※ 乙醇或丙酮（脫色劑）
※ 藏紅花（二次染色或復(fù)染色）
※ 水壺或滴管瓶中的水
※ 顯微鏡載玻片
※ 復(fù)合顯微鏡
6. 革蘭氏染色步驟
a. 將一小滴細(xì)菌樣本放在載玻片上。將細(xì)菌通過(guò)本生燈的火焰加熱三次，將細(xì)菌固定在載玻片上。加熱過(guò)多或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)融化細(xì)菌細(xì)胞壁、扭曲其形狀，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。如果加熱太少，細(xì)菌會(huì)在染色過(guò)程中從載玻片上洗掉。
b. 用滴管將原色（結(jié)晶紫）涂在載玻片上，讓其靜置1分鐘。用不超過(guò)5秒鐘的水輕輕沖洗載玻片，以去除多余的污漬。沖洗時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)去除太多顏色，而沖洗時(shí)間不夠長(zhǎng)可能會(huì)使革蘭陰性細(xì)胞上殘留太多污漬。
c. 用滴管將革蘭氏碘涂在載玻片上，將結(jié)晶紫固定在細(xì)胞壁上。讓它靜置1分鐘。
d. 用酒精或丙酮沖洗載玻片約3秒鐘，然后立即用水輕輕沖洗。革蘭氏陰性細(xì)胞將失去顏色，而革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞將保持紫色或藍(lán)色。然而，如果脫色劑打開(kāi)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，所有細(xì)胞都會(huì)失去顏色！
e. 涂上第二層著色劑藏紅花，靜置1分鐘。用水輕輕沖洗，沖洗時(shí)間不得超過(guò)5秒。革蘭氏陰性細(xì)胞應(yīng)染成紅色或粉紅色，而革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞仍將呈現(xiàn)紫色或藍(lán)色。
f. 使用復(fù)合顯微鏡查看幻燈片�？赡苄枰�500倍至1000倍的放大倍數(shù)來(lái)區(qū)分電池形狀和排列。
影響革蘭氏染色結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。
1.試劑影響。首先應(yīng)確保使用的試劑須有效。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗(yàn)收到存放、使用、過(guò)期后的廢棄處理都應(yīng)有嚴(yán)格規(guī)定。
2.染色菌的選擇。菌齡對(duì)革蘭氏染色結(jié)果的影響是十分大的。染色過(guò)程中選擇的菌應(yīng)是處于活躍生長(zhǎng)期，這樣的細(xì)菌活性強(qiáng)，生理特征明顯，染色結(jié)果準(zhǔn)確度高，一般情況下不會(huì)出現(xiàn)誤差。培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性菌，由于細(xì)胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經(jīng)死亡或者自行溶解了，造成細(xì)胞壁通透性增加，就會(huì)呈現(xiàn)出假陰性。
3.涂菌的狀態(tài)。在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應(yīng)該在無(wú)菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過(guò)程中，若是菌體堆積，也會(huì)極大影響染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。菌落堆積過(guò)多，往往菌體之間變得毫無(wú)縫隙，而其細(xì)胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。同時(shí)，在初染、媒染及復(fù)染的過(guò)程中，應(yīng)將染液覆蓋整個(gè)菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒(méi)有染色。因此在涂片過(guò)程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達(dá)到最佳效果。
4.媒染時(shí)間。媒染時(shí)間對(duì)革蘭氏陰性菌的染色結(jié)果有很大影響。由于媒染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，結(jié)晶紫在碘液長(zhǎng)時(shí)間作用下過(guò)分牢固結(jié)合在菌體細(xì)胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會(huì)導(dǎo)致這種假陽(yáng)性的效果。媒染時(shí)間控制在50-60s為宜。
5.酒精脫色。酒精脫色也是一個(gè)對(duì)結(jié)果影響較大的操作過(guò)程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌最主要的差異是細(xì)胞壁肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖成分會(huì)被酒精溶解，增大了細(xì)胞壁的通透性，結(jié)晶紫及碘復(fù)合物就很快被酒精洗脫，之后就會(huì)被沙黃復(fù)染呈紅色；而陽(yáng)性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無(wú)法進(jìn)入，這樣結(jié)晶紫和復(fù)合物就無(wú)法洗脫出來(lái)使細(xì)胞呈紫色。因此，酒精脫色時(shí)間短，脫色效果不佳，會(huì)導(dǎo)致陰性菌菌體內(nèi)的結(jié)晶紫和復(fù)合物不能有效的全部洗脫出來(lái)，就會(huì)出現(xiàn)明顯的誤差，使陰性菌出現(xiàn)假陽(yáng)性。而洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁被酒精破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的紫色被洗脫，呈現(xiàn)假陰性。洗脫時(shí)間應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制在20s-30s之間，同時(shí)保證洗脫效果。
革蘭氏染色過(guò)程中，在保證試劑有效的前提下，需嚴(yán)格控制的幾個(gè)方面：
染色菌必須是在其活躍期內(nèi)，
涂布狀態(tài)不可太厚，
媒染時(shí)間嚴(yán)格控制在50s-60s之間，
脫色時(shí)間嚴(yán)格控制在20s-30s。
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