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新型重組人內(nèi)毒素結(jié)合肽突變體的構(gòu)建及原核表達(dá)純化
目的 構(gòu)建新型人內(nèi)毒素結(jié)合肽(a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues,EBP_(25))及其突變體(mutant of EBP_(25),mEBP_(25))的原核表達(dá)重組質(zhì)粒,并在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達(dá).方法 采用PCR法,擴(kuò)增EBP_(25)基因,構(gòu)建pET-30-EBP_(25)融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α擴(kuò)增.重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定后,應(yīng)用快速定點(diǎn)突變法將EBP_(25)第2位纈氨酸和第5位谷氨酰胺所對應(yīng)堿基均替換成賴氨酸所對應(yīng)的堿基,突變后重組質(zhì)粒再經(jīng)測序鑒定后,將二者轉(zhuǎn)化至E.coli BL_(21)(DE_3)PlysS后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物采用Western印跡進(jìn)行鑒定后,用His-Tag親和層析對融合蛋白進(jìn)行純化. 結(jié)果 兩次測序結(jié)果 顯示人EBP_(25)和mEBP_(25)重組序列和理論設(shè)計(jì)序列完全一致后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得目的融合蛋白,通過SDS-PAGE電泳、Western 印跡證實(shí)蛋白表達(dá)的特異性,并對蛋白進(jìn)行純化,獲得EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白. 結(jié)論 構(gòu)建、表達(dá)純化了EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白,為進(jìn)一步研究其中和內(nèi)毒素/脂多糖活性奠定了基礎(chǔ).
作 者： 許成燕 劉友生 段光杰 朱江 徐小明 XU Chengyan LIU Yousheng DUAN Guangjie ZHU Jiang XU Xiaoming 作者單位： 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院病理學(xué)研究所,重慶市,400038 刊 名： 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志 ISTIC 英文刊名： JOURNAL OF MEDICAL MOLECULAR BIOLOGY 年，卷(期)： 2010 7(2) 分類號(hào)： Q78 關(guān)鍵詞： 內(nèi)毒素結(jié)合肽 定點(diǎn)突變 原核表達(dá) 純化 endotoxin binding peptide site-directed mutation prokaryotic expression,protein purification【新型重組人內(nèi)毒素結(jié)合肽突變體的構(gòu)建及原核表達(dá)純化】相關(guān)文章：
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