- 相關(guān)推薦
關(guān)于大鼠羊膜細(xì)胞體外培養(yǎng)及其干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)
羊膜位于胎盤絨毛膜內(nèi)側(cè)，是一層無(wú)血管、神經(jīng)、淋巴和肌肉的透明薄膜，可起到對(duì)胎兒的保護(hù)作用，與發(fā)育中的胎兒聯(lián)系緊密。人源羊膜細(xì)胞在受精后第8 天開(kāi)始形成，具有多項(xiàng)分化的潛能，可向三個(gè)胚層細(xì)胞進(jìn)行分化，近年來(lái)研究表明，羊膜上皮細(xì)胞能夠分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞，并合成釋放多巴胺、乙酰膽堿、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)。人羊膜細(xì)胞具有低免疫原性和有效的免疫抑制力，細(xì)胞移植后不會(huì)發(fā)生急性排斥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)從大鼠羊膜分離獲取羊膜細(xì)胞，建立穩(wěn)定培養(yǎng)的條件，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了探討，為其將來(lái)在細(xì)胞移植治療方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料和方法:
1. 1 材料
1. 1. 1 主要儀器:CO2培養(yǎng)箱、凈化工作臺(tái)、倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。
1. 1. 2 主要試劑:DMEM 高糖培養(yǎng)基( Dulbeccosmodified Eagles medium，DMEM)、人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、0.25%含 EDTA 的胰蛋白酶(0. 25% trysin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS 緩沖液購(gòu)自于 Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90 購(gòu)自與 Abcam 公司。CD29、CD44 購(gòu)自于 eBioscience 公司、CD45、CD11b 購(gòu)自于 BD 公司。
1. 1. 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF 級(jí)孕 18 ～ 18. 5 d 的 SD 大鼠，購(gòu)自中國(guó)軍科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):[SCXK-(軍)2014-0004]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用批準(zhǔn)號(hào):ILAS-PL-2014-001。在無(wú)菌條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作分離羊膜組織。
1. 2 方法
1. 2. 1 羊膜細(xì)胞分離及培養(yǎng):SD 孕鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉(0. 01 mL /g)，麻醉后，無(wú)菌條件下開(kāi)腹，機(jī)械性分離子宮層，剝離胎盤，分離羊膜組織置于含有500 U/mL 雙抗的 PBS 溶液中沖洗。將羊膜組織放置在含有500 U/mL 雙抗的 DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，無(wú)菌眼科剪將其剪至1 mm3左右的小塊。將組織懸液移至50 mL 離心管中，1 000 r/min 離心 5min，棄上清液。加入 0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶10 mL，37℃ ，5% CO2條件下消化 20 ～30 min。用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。200 目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液，接種至 25 cm2培養(yǎng)瓶，含10% FBS、10 g/LEGF 和 500 U/mL 雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天細(xì)胞換液，2 ～ 3 d 后細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶85% ～90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。
1. 2. 2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):取培養(yǎng) 2 ～ 4 代細(xì)胞，用0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基終止消化。細(xì)胞計(jì)數(shù)將其稀釋成1 106個(gè)，每個(gè)流式管1 mL 細(xì)胞懸液。每流式管加2 mL PBS 使細(xì)胞混勻，2 000 r/min 離心5 min，棄上清液。重復(fù)加2 mL PBS 重懸細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。每管加 50 L PBS 重懸細(xì)胞，加 抗 體 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室溫孵育 30 min。每管加2 mL PBS 重懸細(xì)胞2000 r/min 離心5 min，棄上清液。各管加300 L PBS 重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)。
1. 2. 3 免疫熒光細(xì)胞染色:取 2 ～ 4 代細(xì)胞，0. 25%含 EDTA 胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的 DMEM 完全培養(yǎng)基終止消化。加入完全培養(yǎng)基重懸，至24 孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖至 70% 作用時(shí)，PBS 沖洗，4% 多聚甲醛(預(yù)冷)固定 10 min。PBS 沖洗 2 次，每次5 mim。1% Tuiton-100 孵育10 min。PBS 沖洗2 次，每次 5 mim。山羊血清工作液每孔 100 L 室溫下封閉30 min。吸去山羊血清工作液，抗體稀釋液稀釋抗體 Oct-4(1∶ 200)、Sox-2(1∶ 200)、SSEA-4(1∶200)、nestin(1∶100)、vimentin(1∶100)，每孔100L，4℃過(guò)夜孵育。PBS 沖洗 3 次，每次 5 min。避光條件下，PBS 稀釋 FITC 標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃避光孵育 30 min。PBS 沖洗 3 次，每次5 min。DAPI 封片劑封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察。
1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 x珋 s 表示，使用 SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析和LSD 檢驗(yàn)，P 0. 05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2. 1 分離細(xì)胞培養(yǎng)分離培養(yǎng)大鼠羊膜細(xì)胞，鏡下，細(xì)胞呈變形蟲(chóng)樣生長(zhǎng)(圖 1a)，生長(zhǎng)速度快(圖 1b)，需隔天換液傳代。本實(shí)驗(yàn)中大鼠羊膜細(xì)胞可傳至6 ～7 代。
2. 2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原結(jié)果經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定大鼠羊膜細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物 CD29、CD44 分別為97. 6%和95. 8%。細(xì)胞表面抗原CD90、CD45 幾乎不表達(dá)，CD11b 有少量表達(dá)(圖2 見(jiàn)文后彩插6)。
2. 3 細(xì)胞免疫熒光鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)果本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物 Oct-4 和 Sox-2(如圖 3)，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物 nestin 和間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物vimentin(如圖 4)，( 圖 3 ～ 4 見(jiàn)文后彩插 7) 并表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物 SSEA-4(如圖 5)�？杀磉_(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 BDNF 和NGF(如圖6)(圖5 ～6 見(jiàn)文后彩插8)。
3 討論
查字典范文網(wǎng)(FANWEN.CHAZIDIAN.COM)
通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物 Oct-4 和 Sox-2，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物 vimentin 和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物 nestin，表達(dá) SSEA-4。可表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子標(biāo)記物 BDNF 和 NGF，這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是神經(jīng)元生長(zhǎng)與存活所必需的蛋白質(zhì)分子。羊膜細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物 CD29和 CD44，其表達(dá)量均在95%以上，CD45、CD90 幾乎不表達(dá)，CD11-b 有少量表達(dá)。Oct-4 可參與胚胎干細(xì)胞的自我更新，調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的多分化潛能。有研究指出 Oct-4 在羊膜細(xì)胞核內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)均可表達(dá)。Miki 等人研究結(jié)果表明人羊膜上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞都可表達(dá) Sox-2、Oct-4 等干細(xì)胞標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在大鼠羊膜細(xì)胞中 Oct-4 在胞核和胞質(zhì)中均有表達(dá)。Nestin 被認(rèn)為是在胚胎和成體組織中的多能性神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物。在有絲分裂活躍的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)，現(xiàn)作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用。人羊膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化，可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞并表達(dá) nestin、Oct-4 和 Sox-2。Vimentin 起到維持細(xì)胞形態(tài)，胞質(zhì)完整性和穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用。有研究發(fā)現(xiàn)在妊娠 15 d 的大鼠胚胎中檢測(cè)有nestin 和 vimentin 的表達(dá)，人羊膜細(xì)胞未分化的前體細(xì)胞中也存在 nestin、vimentin 表達(dá)。
有研究發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細(xì)胞和人羊膜細(xì)胞中都表達(dá) nestin 和vimentin 因子。SSEA-4 被認(rèn)為是特異性人胚胎干細(xì)胞和卵泡期胚胎早期卵裂的標(biāo)記物，也被視為成體間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物。Ilancheran 等與他的同事 MIKI 等分別通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記物 SSEA-4。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)出大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá) nestin、vimentin 和 SSEA-4。NGF 和 BDNF 都是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中成員。NGF 同時(shí)也是一種信號(hào)分子，缺乏 NGF 對(duì)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)作用，神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)凋亡。BDNF 可促進(jìn)神經(jīng)元的存活并能支持神經(jīng)元和突觸的生長(zhǎng)和中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志 2015 年 4 月第 25 卷第 4 期 Chin J Comp Med，April 2015，Vol. 25. No. 436分化。BDNF 可減少突觸喪失、矯正部分異�；虮磉_(dá)、阻止神經(jīng)元萎縮且改善與年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙，提高學(xué)習(xí)記憶能力。研究人員發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞和人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞可合成釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 BDNF、NGF 和 NT-3，其他的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)后檢測(cè)沒(méi)有表達(dá)。多個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)移植人羊膜細(xì)胞到損傷部位能修復(fù)受損 傷 的 神 經(jīng) 元，BDNF 的 表 達(dá) 水 平 同 時(shí) 增加，說(shuō)明人羊膜細(xì)胞很可能通過(guò)釋放 BDNF 來(lái)修復(fù)損傷神經(jīng)元的功能。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)細(xì)胞免疫熒光方法也發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF 和 NGF。
人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD29、CD44、CD73、CD90、CD166 和 CD105，不表達(dá)骨髓造血標(biāo)記物 CD34 和 CD45、單核細(xì)胞標(biāo)記物CD114 和巨噬細(xì)胞標(biāo)記物 CD11b。Murphy等在研究人羊膜上皮細(xì)胞特點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，人羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)上皮粘附分子 EpCAM，幾乎不表達(dá) CD90和 CD105。而人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá) CD90、CD73 和 CD105，其表達(dá)量都在 95% 以上，CD45、CD34 表達(dá)量少于 2%。Bailo 等發(fā)現(xiàn)人羊膜細(xì)胞表達(dá) CD105、CD73、CD90 和 CD29，不表達(dá) CD34、CD45、CD14 和 CD3[18]。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)到大鼠羊膜細(xì)胞表達(dá) CD29 和 CD44，不表達(dá) CD90、CD45，少量表達(dá) CD11b。羊膜細(xì)胞易于分離培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，免疫原性低，并有向三個(gè)胚層分化的潛能，在相關(guān)疾病的治療中具有很好的前景。本實(shí)驗(yàn)較為系統(tǒng)地檢測(cè)了大鼠羊膜細(xì)胞的四類干細(xì)胞標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細(xì)胞可表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物 Oct-4 和 Sox-2、胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物 SSEA-4、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物vimentin 和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物 nestin，并同時(shí)還表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子 BDNF 和 NGF。由此，我們推測(cè)大鼠羊膜細(xì)胞很可能具有某些間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的特性，為相關(guān)基礎(chǔ)研究和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一些線索。
【大鼠羊膜細(xì)胞體外培養(yǎng)及其干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)】相關(guān)文章：
大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)表型鑒定與標(biāo)記04-27
新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定05-02
兔羊膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)和增殖04-26
大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)04-30
大鼠子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)試驗(yàn)05-02
昆明白小鼠胚胎干細(xì)胞分離與體外培養(yǎng)04-27
精原干細(xì)胞移植及體外培養(yǎng)研究進(jìn)展04-26
骨髓單個(gè)核細(xì)胞的提取、分離、標(biāo)記和體外培養(yǎng)04-29