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研究逍遙散乙醇提取物的乙酸乙酯譜效關(guān)系論文
中藥的“譜- 效”關(guān)聯(lián)是指構(gòu)建中藥的“譜”和適合的藥效評價模型，采用數(shù)據(jù)處理技術(shù)將圖譜數(shù)據(jù)和藥理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，建立譜- 效關(guān)系。測定1H-NMR 譜圖需要較少樣品，掃描時間短，容易獲得，因此被廣泛應(yīng)用。1H-NMR 圖譜可以客觀、全面地反映中藥化學(xué)成分的特征。陳璟等在當(dāng)前中藥指紋圖譜譜效相關(guān)性研究思路的基礎(chǔ)上提出了基于“工藝- 指紋圖譜- 效應(yīng)”研究模式。目前常用的譜- 效關(guān)系分析方法主要有灰度關(guān)聯(lián)分析、相關(guān)分析、回歸分析和聚類分析。逍遙散出自宋代《太平惠民合劑局方》，由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、(炙)甘草、茯苓、干姜和薄荷8 味藥材組成，現(xiàn)代臨床以及藥理研究表明逍遙散有明顯的抗抑郁作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)逍遙散低極性組分抗抑郁作用明顯，采用灰度關(guān)聯(lián)分析和相關(guān)分析對XYE-E 的譜效關(guān)系進(jìn)行研究，表征其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為逍遙散的新藥效開發(fā)提供依據(jù)。
1 材料和試劑
1.1 植物材料
逍遙散藥材組成為：柴胡30 g，當(dāng)歸30 g，白術(shù)30 g，白芍30 g，茯苓30 g，甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g;以上藥材均購自山西省華陽藥業(yè)有限公司，經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定為正品。
1.2 儀器和試劑
RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);Bruker 600 MHz Avance Ⅲ NMR 譜儀(德國Bruker公司);Centrifuge TDL-5 型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);BSA124S 分析天平(SI 德國賽多利斯公司);溫度計;計時器;有機(jī)玻璃缸等。鹽酸文拉法辛膠囊(25 mg/ 粒，批號120401，成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司);氘代甲醇(99.8%，德國默克公司)。
1.3 動物
雄性ICR 小鼠，SPF 級，動物許可證號：SCXK(京)2011-0012，18~22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物自然晝夜節(jié)律光照，適應(yīng)1 周后進(jìn)行實驗。
2 方法
2.1 XYE-E 的制備
XYE-E 按照以下工藝進(jìn)行制備: 處方量的逍遙散藥材，加入8 倍量75% 乙醇回流提取1.5 h，濾過，濾液濃縮至一定量后，加等倍量的乙酸乙酯萃取，振搖0.5 h，靜置0.5 h，共萃取3 次，合并萃取液，濃縮，蒸干得XYE-E。
2. 2 XYE-E 的1H-NMR 圖譜測定
稱取XYE-E 約25 mg，加700 μL 氘代甲醇溶解，溶解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，13 000 rpm 轉(zhuǎn)低溫離心10 min，移取600 μL 上清液于核磁管中，平行制備6 份，進(jìn)行1H-NMR 測定。XYE-E 在25℃下于600 MHz NMR 儀上測定(頻率600.13 MHz)，采用ZG30 序列，掃描次數(shù)為64，脈沖間隔為1.0 s，延遲時間為5.0 s。氘代甲醇(δ 3.30 ppm)用于鎖場和定標(biāo)。
2.3 小鼠懸尾實驗[
雄性ICR 小鼠適應(yīng)1 周后，隨機(jī)分為3 組，每組12只，分別為空白組，陽性組(鹽酸文拉法辛0.05 g·kg-1)，XYE-E 組(生藥46 g·kg-1)。XYE-E 使用前用0.5%CMC-Na 與0.5% 吐溫80 混合物稀釋至相應(yīng)濃度，鹽酸文拉法辛使用生理鹽水稀釋至同等濃度，各組灌胃給藥20 mL·kg-1，空白組給予等量色拉油，連續(xù)14 d。末次給藥1 h 后，將小鼠尾尖1 cm 處黏貼于懸掛鉤上，并且手托小鼠將其掛入動物行為視頻分析系統(tǒng)觀察箱中，記錄6 min 內(nèi)小鼠的絕望行為，分析后4 min 內(nèi)小鼠的不動時間。
2.4 小鼠強(qiáng)迫游泳實驗
動物分組及給藥同“2.3”項下。末次給藥1 h 后，用動物行為視頻分析系統(tǒng)記錄6 min 內(nèi)小鼠的游泳行為狀況，分析后4 min 內(nèi)小鼠的不動時間。
2.5 數(shù)據(jù)分析核磁圖譜
采用MestReNova 進(jìn)行處理。譜- 效的數(shù)據(jù)處理采用相關(guān)分析(SPSS 16.0)和灰度關(guān)聯(lián)分析。
3 結(jié)果與分析
3.1 藥效學(xué)評價
XYE-E 對小鼠懸尾實驗和強(qiáng)迫游泳實驗中不動時間的影響，XYE-E 能減少小鼠懸尾實驗和強(qiáng)迫游泳實驗中的不動時間，與空白對照組比較均具有顯著性差異(P < 0.01)，表明XYE-E具有明顯的抗抑郁作用。
3.2 XYE-E 特征峰的選擇與定量
為XYE-E 的1H-NMR 圖譜，根據(jù)文獻(xiàn)共指認(rèn)出14 種化學(xué)物質(zhì)，分別為柴胡皂苷類，阿魏酸，藁本內(nèi)酯，白術(shù)內(nèi)酯，芍藥苷，甘草苷等物質(zhì)。在1H-NMR 圖譜中，共振峰面積或峰高與產(chǎn)生該共振峰的質(zhì)子數(shù)成正比，這是定量的依據(jù)，在沒有對照品時，可利用特征峰相對含量法對物質(zhì)的含量進(jìn)行宏觀分析。用于定量分析的特征峰應(yīng)不受其他信號干擾，并且達(dá)到特征峰兩側(cè)的基線平坦。對提取物核磁圖譜采用0.01 分段積分、歸一化處理后，分別求算14 種化學(xué)物質(zhì)特征峰的相對峰面積，用相對峰面積表示物質(zhì)的相對含量。
3.3 灰度關(guān)聯(lián)分析
為了進(jìn)一步研究逍遙散提取物中14 種活性成分對抗抑郁作用的貢獻(xiàn)大小，進(jìn)行了灰度關(guān)聯(lián)分析。令Y=(y1,y2,......,yn) 為藥效數(shù)據(jù)向量，Si=(Si,1,Si,2,......Si,n) 為相對峰面積數(shù)據(jù)向量，其中i=1,2,......,m)。(1)原始數(shù)據(jù)變換：將各原始數(shù)據(jù)除以該列數(shù)據(jù)的均值，進(jìn)行規(guī)格化處理。(2)計算灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)：其中;△ij=|yi-sij |(3)計算灰色關(guān)聯(lián)度：(4)排列順序：XYE-E 的1H-NMR 圖譜與FST 和TST 不動時間的灰度關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，依據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小，確定了各成分對抗抑郁作用貢獻(xiàn)的大小順序，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷E，柴胡皂苷F，柴胡皂苷G，柴胡皂苷b2與藥效相關(guān)度較高(相關(guān)度大于0.700)。
3.4 相關(guān)分析
將1H-NMR 圖譜中指認(rèn)化學(xué)物質(zhì)的相對峰面積與其FST 和TST 不動時間的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，利用SPSS 16 統(tǒng)計軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)分析法(Bivariate)，分析結(jié)果見表3。從表3 可以看出，柴胡皂苷d 和柴胡皂苷E 與FST 不動時間的相關(guān)性較高(P<0.05，P<0.01);柴胡皂苷b2，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷G 與TST 不動時間的相關(guān)性較高(P<0.05，P<0.01)。與灰度關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果一致，說明柴胡皂苷是逍遙散中發(fā)揮抗抑郁作用的主要成分，同時也證實了柴胡在逍遙散中的君藥地位。
3.5 強(qiáng)迫引入回歸分析
采用SPSS 中多元線性回歸分析中的強(qiáng)迫引入法(enter)對相關(guān)性大的化學(xué)成分(P<0.05)進(jìn)行多元回歸分析，以有效成分峰面積作為自變量，F(xiàn)ST和TST 不動時間為因變量，建立方程。在14 個色譜峰中X4(柴胡皂苷d)、X6(柴胡皂苷E)、X8(柴胡皂苷G)3 個與藥理數(shù)據(jù)密切相關(guān)的色譜峰被引人回歸方程。所得方程為：YFST= -90.88-210.88X4+1 496.32X6(F=18.437，P=0.021，R2=0.925)Y T S T= - 1 2 7 3 . 2 5 + 7 9 3 2 . 7 9 X 8 ( F = 1 0 . 6 7 7 ，P=0.031，R2=0.727)FST 和TST 模型擬合后的決定系數(shù)R2 分別為0.925 和0.727，即變量的變差可以解釋全部抗抑郁藥理活性變化的93% 和73%。模型的方差分析均顯示P<0.05，說明此回歸模型有統(tǒng)計學(xué)意義。FST 和TST 殘差的分布結(jié)果符合正態(tài)分布假設(shè)，預(yù)測值的累積概率與觀測值的累積概率的散點基本散布在直線上，說明自變量與因變量之間符合線性關(guān)系，并且標(biāo)準(zhǔn)化殘差在0 的附近波動，滿足殘差的方差齊性條件。強(qiáng)迫引入法分析結(jié)果顯示柴胡皂苷d，柴胡皂苷E，柴胡皂苷G 所對應(yīng)的化學(xué)成分對FST 和TST 不動時間具有較大影響。結(jié)合灰度關(guān)聯(lián)分析和相關(guān)分析研究，表明柴胡皂苷d、柴胡皂苷E 和柴胡皂苷G 與藥效的相關(guān)性最大，但是其余未指認(rèn)的色譜峰所對應(yīng)的化學(xué)成分是否有抗抑郁作用，有待于進(jìn)一歩研究。
4 討論
XYE-E 的1H-NMR 圖譜包含了XYE-E 中所有物質(zhì)的氫信號，通過對1H-NMR 指紋圖譜中的特征峰進(jìn)行分析，共指認(rèn)出14 種化合物，包括柴胡皂苷類物質(zhì)，白術(shù)內(nèi)酯類物質(zhì)以及甘草苷、芍藥苷等。譜效關(guān)系研究可以發(fā)現(xiàn)和跟蹤藥效物質(zhì)，指導(dǎo)制備工藝的優(yōu)化，保證中藥的臨床療效。本研究發(fā)現(xiàn)與XYE-E 抗抑郁藥效密切相關(guān)的物質(zhì)主要是柴胡皂苷，甘草苷和芍藥苷與抗抑郁藥效相關(guān)度并不高。采取不同提取分離工藝所得提取物的化學(xué)組分和含量均不同，從而引起圖譜特征信息變化和相關(guān)藥效的改變。中藥化學(xué)組成復(fù)雜，單張化學(xué)圖譜難以完整地反映中藥的化學(xué)組成特征，因此建立多源譜效關(guān)系，完整表征中藥復(fù)方的整體化學(xué)特征顯得尤為重要。本研究中未被指認(rèn)的色譜峰需進(jìn)一步分析，對XYE-E 中的化學(xué)成分進(jìn)行更深入的分析和譜效關(guān)系研究。
綜上所述，中藥復(fù)方譜效關(guān)系的研究對于優(yōu)化中藥生產(chǎn)工藝，追蹤和篩選藥效活性成分，加快中藥新藥研究等方面具有重要的推動作用。
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