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真菌的鑒定
真菌的鑒定麥曲在黃酒釀造中起著重要的作用。分析微生物在麥曲中的區(qū)系分布和其中微生物菌群的系統(tǒng)發(fā)育，對于理順麥曲中的微生物與產(chǎn)地環(huán)境的相互關(guān)系、建立麥曲微生物生態(tài)數(shù)據(jù)庫和麥曲品質(zhì)的分子評價指標(biāo)，具有重要的指導(dǎo)意義。
不同培養(yǎng)基進(jìn)行真菌平板分離的結(jié)果
文章來源華夏酒報
為了最大限度地分離出麥曲中的真菌，采用了三種培養(yǎng)基，其中PDA和CPK培養(yǎng)基是用來分離真菌的常用培養(yǎng)基，此外還使用了麥曲浸提液培養(yǎng)基(WQE)，因為它的營養(yǎng)成份近似于微生物最原始的生存環(huán)境。對于三種培養(yǎng)基進(jìn)行平板菌落計數(shù)，PDA和WQE培養(yǎng)基上的菌落數(shù)在48小時后達(dá)到最大，菌落數(shù)分別達(dá)到4.7×104cfu/g干曲和8.4×104cfu/g干曲。而在CPK培養(yǎng)基上，由于本身是合成培養(yǎng)基，營養(yǎng)不夠豐富，所以24小時后開始慢慢形成菌落，56小時后達(dá)到最大值，僅為1.4×104 cfu/g干曲。
不同培養(yǎng)基的麥曲真菌分布
根據(jù)菌落大孝形態(tài)和顏色等表型特征進(jìn)行初步區(qū)分，共得到24株純種菌株。各個純株在3種分離培養(yǎng)基上的分布情況見表1。從PDA，CPK和WQE三種培養(yǎng)基上分離得到的純種真菌分別為8種、18種和11種。PDA是營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，但分離出來的真菌數(shù)目最少。而近似于微生物最原始生存環(huán)境的WQE培養(yǎng)基分離得到的真菌種類，要比預(yù)期的少。在合成培養(yǎng)基CPK上分離獲得的真菌種類最多，暗示在低營養(yǎng)長時間的培養(yǎng)條件下，能夠較多地回收得到麥曲樣品中的真菌。
將10—5稀釋度以上檢測到的真菌認(rèn)為是麥曲樣品中的優(yōu)勢菌。從表中可以看出，不同的培養(yǎng)基分離出來的優(yōu)勢菌是不一樣的，且每一種培養(yǎng)基都能檢測到其它培養(yǎng)基所不能檢測到的優(yōu)勢菌株，所以必須聯(lián)合使用多種分離培養(yǎng)基，才能準(zhǔn)確解析麥曲中的真菌多樣性。另外，在分離培養(yǎng)基中有必要加入去氧膽酸鈉來抑制菌絲的蔓延。
純種真菌的鑒定
對分離獲得的24株真菌純株進(jìn)行形態(tài)初步鑒定和基于ITS序列的分子鑒定，具體測序結(jié)果見表 綜合平板分離和測序的結(jié)果可以看出，通過大規(guī)模的系統(tǒng)分離培養(yǎng)方法確定麥曲中的優(yōu)勢真菌為：傘枝犁頭霉(Absidia corymbifera—like)，米曲霉(Aspergillus oryzae)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus.niger)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、季氏畢赤氏酵母(Pichia guilliermondii)和異常畢赤酵母(Pichia anomala)。
本研究分離鑒定出的焦曲霉(Aspergillus ustus)、土曲霉(Aspergillus terreus—like)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、桔青霉(Penicillium citrimum)、季氏畢赤酵母、異常畢赤酵母，小孢根霉，多變根毛霉(Rhizomucor variabilis)、球毛殼霉(Chaetomium globasum)、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)和Phaeosphaeria fu-ckelii等菌株在以前的研究結(jié)果中均未出現(xiàn)。所用的麥曲是人工腳踏成型，此前公司采用培養(yǎng)法對機(jī)制麥曲中的真菌進(jìn)行過研究，機(jī)制麥曲中的優(yōu)勢真菌為傘枝犁頭霉(Absidia corymbifera)、米根霉(Rhizopus oryzae)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。除了米根霉以外，其余優(yōu)勢真菌與本文的研究結(jié)果一致。
人工腳踏成型麥曲中的真菌種類比機(jī)械壓制成型麥曲豐富，其原因是人工踩制曲坯能起到提漿作用，賦予曲坯表面較豐富的營養(yǎng)和較好的保溫功能，因而比機(jī)械壓制成型的曲坯更適合微生物的生長繁殖。
對分離獲得的真菌純株序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，所分離得到的純種菌株大致分為11個屬，分別是曲霉屬(Aspergillus)、犁頭霉屬(Absidia)、根霉屬(Rhizopusmucor)、毛霉屬(Rhizopus)、青霉屬(Penicillium)、散囊菌屬(Eurotium)、枝孢屬(Cladosporium)、畢赤酵母屬(Pichia)、球毛殼屬(Chaetomium)、念珠屬(Candida)和伊薩酵母屬(Issatchenkia)，反映出紹興黃酒成品麥曲中真菌的資源非常豐富。從屬的分類水平來看，在腳踏曲中出現(xiàn)的屬除了散囊菌屬(Eurotium)、畢赤酵母屬(Pichia)和球毛殼屬(Chaetomium)外，其它的屬在機(jī)制曲中均有出現(xiàn)。
本文所得到的序列用菌名加代號表示，來自于GenBank數(shù)據(jù)庫的序列用菌名加登錄號表示。比例尺代表5%的核酸序列差異性。
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