微生物實驗工作總結(jié)

　　一、培養(yǎng)基

　　（一）培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分

　　一般都含有水、碳源、氮源和無機(jī)鹽，有些微生物需要添加特殊營養(yǎng)物質(zhì)（如培養(yǎng)乳酸桿菌時需添加生長因子：維生素）

　　高考警示鐘：自養(yǎng)微生物與異養(yǎng)微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)不同

　　(1)自養(yǎng)微生物所需的碳源來自含碳的無機(jī)物（如CO2），而異養(yǎng)微生物需要的碳源來自含碳的有機(jī)物，因此可根據(jù)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)判斷微生物的代謝類型。

　　(2)含氮無機(jī)物不但能給自養(yǎng)微生物提供氮源，也能作為能源物質(zhì)，提供能量，如NH3既作為硝化細(xì)菌的氮源也作為能源。

　�。ǘ�）培養(yǎng)基的配制原則

　　(1)目的明確。要根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等選擇原料、配制培養(yǎng)基。

　　(2)營養(yǎng)要協(xié)調(diào)。各種營養(yǎng)物質(zhì)要保證適當(dāng)?shù)臐舛群捅壤�。營養(yǎng)物質(zhì)比例過低，不能滿足微生物生長；濃度過高則會抑制微生物的正常生長。

　　(3)pH要適當(dāng)。不同微生物生長所需pH不同。如細(xì)菌為中性或微堿性（6.5～7.5）；霉菌等真菌為酸性（5.0～6.0）。

　�。ㄈ�）培養(yǎng)基的分類及作用：

　　1.物理性質(zhì)：根據(jù)是否添加瓊脂等凝固劑

　　（1）液體培養(yǎng)基：不加凝固劑，常用于工業(yè)生產(chǎn)

　　（2）固體培養(yǎng)基：加凝固劑，常用于微生物分離、鑒定、活菌計數(shù)

　　2.用途或功能

　�。�1）選擇培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入或去除某種化學(xué)物質(zhì)，允許特定種類的微生物生長,同時抑制或阻止其他種類微生物生長。

　　常見例子：

　　①培養(yǎng)基中加入青霉素，篩選酵母茵或霉菌等真菌；

　�、谂囵B(yǎng)基中加入高濃度食鹽，篩選金黃色葡萄球菌；

　�、蹮o氮培養(yǎng)基，篩選固氮微生物；

　�、軣o碳培養(yǎng)基，篩選自養(yǎng)微生物；

　�、菀允�油為唯一碳源，選擇能分解石油的微生物；

　　⑥以尿素為唯一氮源，篩選尿素分解菌；

　　⑦以纖維素為唯一碳源，通過是否產(chǎn)生透明圈篩選纖維素分解菌。

　�、鄬⑴囵B(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)，分離耐高溫的微生物。

　�。�2）鑒別培養(yǎng)基：根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,以鑒別不種類的微生物。

　�、僖良t一美藍(lán)培養(yǎng)基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，茵落呈深紫色，并帶有金屬光澤)；

　　②培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，鑒定尿素分解菌；

　�、叟囵B(yǎng)基中加入剛果紅（CR），鑒定纖維素分解菌。

　　注意：

　�、俨《緸榉羌�(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物體，專營活細(xì)胞寄生，目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)，需接種在動植物組織中才能增殖。常用于培養(yǎng)病毒的是活雞胚。

　　②加入培養(yǎng)基中的凝固劑(如瓊脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。

　　二、無菌技術(shù)

　�。ㄒ唬╆P(guān)鍵

　　獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌入侵。

　�。ǘ�）消毒、滅菌:

　　二者主要區(qū)別中：芽孢和孢子是否存活（芽孢是微生物度過不良環(huán)境的體眠體，而孢子是微生物進(jìn)行無性生殖時的繁殖體即無性生殖細(xì)胞。）

　　1.消毒:使用較為溫和的物理或化學(xué)方法，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體等有害的微生物(不包括孢子和芽孢)

　　常用方法

　　應(yīng)用范圍

　　巴氏消毒法：70～75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min

　　一些不耐高溫的物體如牛奶

　　煮沸消毒法：在100℃水浴中煮沸5～6 min

　　一般物品

　　化學(xué)藥劑消毒法：用乙醇、氯氣、KMnO4等藥劑來殺死或抑制細(xì)菌生長或繁殖

　　可用來對環(huán)境、雙手和衣物等消毒

　　紫外線消毒法：30W紫外燈照射30min

　　接種室、接種箱、超凈工作臺

　　2.滅菌:使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子

　　常用方法

　　應(yīng)用范圍

　　灼燒滅菌法：酒精燈火焰

　　接種工具如接種環(huán)、接種針等

　　干熱滅菌法：在160～170℃加熱1～2h

　　如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具

　　高壓蒸汽滅菌：壓力為100 kPa，溫度為12l℃的條件下，維持15～30 min

　　培養(yǎng)基及容器的滅菌

　　注意：

　�。�1）酒精消毒用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精效果最好，濃度過低。殺菌力弱，濃度過高，會使菌體表面蛋白凝固成一層保護(hù)膜，乙醇分子不能進(jìn)入其中

　　（2）關(guān)于高壓蒸汽滅菌注意以下幾點：

　�、賶毫�為100 kPa，溫度為12l℃的條件下，維持15～30 min；

　　②注意同時旋緊相對的兩個螺旋，使螺栓松緊一致；

　�、鄣綔缇鷷r間后，當(dāng)壓力表的壓力降為零時，才能打開排氣閥，否則滅菌鍋的液體會沖出容器，造成污染。

　�。�3）滅菌消毒的原理，就是通過一定理化手段，使病原茵蛋白質(zhì)變性，失去生命活性。

　　（4）灼燒滅菌用的是酒精燈火焰的充分燃燒層。

　　三、微生物的純化培養(yǎng)技術(shù)

　�。ㄒ唬┏Ｓ眉�(xì)菌培養(yǎng)基——牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制流程：

　　計算

　　稱量

　　溶化

　　滅菌

　　注意：據(jù)配方計算配制一定體積培養(yǎng)基時各成分的用量

　　注意：

　　①倒平板時，燒杯口要通過酒精燈火焰滅菌。

　�、谄桨謇淠�后要將平板倒置，既可防止皿蓋上凝結(jié)的水滴滴入培養(yǎng)基造成污染；又可使培養(yǎng)基表面的水分更好的揮發(fā)。

　�。ㄕ{(diào)PH）

　　倒平板

　　注意：

　�、倥Ｈ飧噍^粘稠，應(yīng)玻棒挑取，在稱量紙上稱量

　�、谂Ｈ飧嗟鞍纂艘孜�潮，動作要迅速

　　注意：

　�、偃芑�瓊脂時要不斷攪拌，防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂；

　　②加熱過程中部分水分蒸發(fā)，待瓊脂完全溶化后應(yīng)補(bǔ)加蒸餾水，以保持溶液的濃度

　　注意：

　　由于不同微生物適宜的pH不同，因此在熔化后，必須用NaOH或HCl來調(diào)節(jié)pH

　　注意：

　　①用高壓蒸汽滅菌法

　�、谂囵B(yǎng)基先調(diào)PH再滅菌

　　③一般是培養(yǎng)基先滅菌再倒平板

　　計算

　　稱量

　　溶化

　　滅菌

　　注意：據(jù)配方計算配制一定體積培養(yǎng)基時各成分的用量

　　注意：

　�、俚蛊桨鍟r，燒杯口要通過酒精燈火焰滅菌。

　�、谄桨謇淠�后要將平板倒置，既可防止皿蓋上凝結(jié)的水滴滴入培養(yǎng)基造成污染；又可使培養(yǎng)基表面的水分更好的'揮發(fā)。

　�。ㄕ{(diào)PH）

　　倒平板

　　注意：

　　①牛肉膏較粘稠，應(yīng)玻棒挑取，在稱量紙上稱量

　�、谂Ｈ飧嗟鞍纂艘孜�潮，動作要迅速

　　注意：

　�、偃芑�瓊脂時要不斷攪拌，防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂；

　　②加熱過程中部分水分蒸發(fā)，待瓊脂完全溶化后應(yīng)補(bǔ)加蒸餾水，以保持溶液的濃度

　　注意：

　　由于不同微生物適宜的pH不同，因此在熔化后，必須用NaOH或HCl來調(diào)節(jié)pH

　　注意：

　�、儆酶邏赫羝麥缇�法

　�、谂囵B(yǎng)基先調(diào)PH再滅菌

　�、垡话闶桥囵B(yǎng)基先滅菌再倒平板

　�。ǘ�）純化大腸桿菌

　　1．原理：在培養(yǎng)基上將細(xì)菌稀釋或分散成單個細(xì)胞，使其長成單個的菌落，這個菌落就是純化的細(xì)菌菌落。

　　2．微生物接種方法：

　　平板劃線法（只可純化）和稀釋涂布平板法（既可純化又可計數(shù)）

　　(1)平板劃線法：固體培養(yǎng)上→連續(xù)劃線→逐步稀釋→單個細(xì)胞繁殖而成的菌落 (如圖)

　　注意：

　　a.用接種環(huán)取菌種之前、每次劃線之前和劃線結(jié)束都要進(jìn)行灼燒滅菌，灼燒后要在酒精燈附近冷卻后再操作；

　　燒灼時期

　　目的

　　取菌種前

　　殺死接種環(huán)上原有微生物

　　每次劃線前

　　殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留菌種，使下次劃線的菌種直接來自于上次劃線末端，使每次劃線菌種數(shù)目減少，達(dá)到分離菌株的目的

　　接種結(jié)束后

　　殺死接種環(huán)上殘存的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者

　　b.劃線時不要劃破培養(yǎng)基，如果采用分段劃線法操作從第二次操作應(yīng)總在上一次劃線末端開始，首尾區(qū)不能相連；

　　c.操作必須始終在酒精燈火焰旁進(jìn)行。

　　(2)稀釋涂布平板法：10倍系列稀釋操作(一系列梯度稀釋) →稀釋度足夠高的菌液→分散成單個細(xì)胞→單個菌落

　　稀釋涂布平板的操作比較復(fù)雜，且各個細(xì)節(jié)均需保證“無菌”，應(yīng)特別注意：

　　a.配制系列梯度稀釋液時，必須用無菌水配制；

　　b.涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在燒杯中滴盡，沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰引燃。不要將過熱的涂布器放入盛有酒精的燒杯中，一面引燃其中的酒精；

　　c. 吸管頭不要接觸任何其他物體；吸管要在酒精燈火焰周圍使用。

　　3．菌種的保存

　　保存時間

　　保存方法

　　具體方法

　　后續(xù)處理

　　頻繁

　　使用

　　臨時保藏法

　　將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)，長成菌落后，放入4_℃的冰箱中保藏

　　每3～6個月需重新接種。否則菌種容易被污染或產(chǎn)生變異

　　長期

　　保存

　　甘油

　　管藏法

　　在3 mL甘油瓶中，裝入1 mL甘油后滅菌，將1 mL菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中與甘油充分混合

　　放入－20_℃的冷凍箱中保存

　　將菌種放在低溫環(huán)境中保藏的目的是降低微生物的新陳代謝速率。

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